Chemische Zusammensetzung und antimikrobielle Eigenschaften der ätherischen Öle von Leptospermum scoparium J

Chemische Zusammensetzung und antimikrobielle Eigenschaften der ätherischen Öle von Leptospermum scoparium J.R. et G. Forst. und anderer Teebaumöle der Gattungen Kunzea, Leptospermum und Melaleuca unter besonderer Berücksichtigung von Handelsölen

[FrankChristoph]

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Upon the hills are Myrtles blooming –Dark teatree glades

Toss their light foam like banners triumphing,

White Burgan wades

Knee-deep in summer grass, a mounth ago

Heath-myrtle sweet

Laughed and turned rosy – crimsoning her snow

On flying feet.

Of scent she brought dear memories.

The gumsStar-crowned and tall

Baring their limbs as every zephyr comes,

Sing over all.

N.N.

A. Einleitung

2•Vergleichende Untersuchung zur Qualität und Quantität der antimikrobiellen Wirkung der fünf Teebaumöle s.

l. Heutzutage wird als Antiseptikum und Desinfiziens in großem Maße Australisches Teebaumöl genutzt. Es soll durch in vitro Testung eine Grundlage erarbeitet werden,

mit Hilfe derer die antimikrobielle Wirksamkeit der anderen Teebaumöle pharmazeutisch nutzbar gemacht werden kann. Dabei verdient der β-Triketon-Komplex des Manukaöls besonderes Interesse. Der Einsatz von Mischungen wirksamkeitsrelevanter Substanzen ist von Vorteil, wenn deren Beitrag zur Wirkung additiv oder überadditiv ist. In diesem Sinne ist ein ätherisches Öl zu verstehen. Trotzdem wird dabei immer von „wirksamkeitsbestimmenden“ Ölkomponenten gesprochen. Vor diesem Hintergrund sollen einzelne Ölkomponenten, Mischungen von Ölkomponenten sowie Mischungen von Ölen und Ölfraktionen der Teebaumöle vergleichend in vitro getestet werden.

Es sollen damit Alternativen aufgezeigt werden, zu denen im Handel befindlichen terpenreichen Mischungen aus Myrtaceen-Öle, die breiten Einsatz bei der Behandlung

von Infektionen der Atemwege haben. In Bezug auf Manukaöl soll ein weiterer Aspekt bearbeitet werden. Dieser ergab sich aus der bekannten Tatsache, daß in Neuseeland Leptospermum scoparium in verschiedenen Chemotypen vorkommt. Diese Art von Polychemismus ist bei den Myrtaceae weit verbreitet. Durch chemisch-analytische Untersuchungen an Wildpflanzen und Kulturvarietäten soll dieser chemo-systematische Aspekt näher beleuchtet werden.

A. Einleitung

Familie der Myrtaceae

2.1 Die Familie der Myrtaceae gehört zur Ordnung der Myrtales6666666666666666 und umfaßt heute etwa 150 verschiedene Gattungen und ca. 3000 Arten. Davon entfallen allein auf den Kontinent Australien ca. 75 Gattungen (55 endemisch) und über 1500 Arten. In der nördlichen Hemisphäre ist die Familie recht schwach vertreten, mit Ausnahme weniger Vorkommen in Südostasien. Auf dem afrikanischen Kontinent ist sie auch eher bedeutungslos. Letzte reserklärt sich durch die Tatsache, daß die drei Kontinente Australien, Antarktis und Südamerika bis vor ca. 49 Mio. Jahren über Landbrücken miteinander verbunden waren, wohingegen Afrika und Indien sich bereits vor ca. 65 Mio. Jahren vom Urkontinent Gondwana abgetrennt hatten. So ähneln sich ganz allgemein die Flora von Australien und Südamerika - sie teilen sich beispielsweise einige bekannte Gattungen, wie Lomatia und Nothofagus – nicht jedoch die Flora von Australien und Afrika, auf Grund der längeren Periode der Trennung voneinander im letzten Fall. Die Familie der Myrtaceae wird in zwei, bezüglich der Gattungszahl etwa gleich große Unterfamilien eingeteilt. Die Myrtoideae umfassen die fleischig fruchtenden Gattungen, die Leptospermoideae umfassen die trocken fruchtenden Gattungen (WILSON, 1999).

2.1.1 Unterfamilie Myrtoideae

Die Unterfamilie Myrtoideae (etwa 75 Gattungen) ist in Mittel- und Südamerika mit 46 Gattungen vertreten, von denen 45 endemisch sind. In Afrika findet man zwei Gattungen (nicht endemisch). In Australasien, Asien und dem indischen Subkontinent kommen 26 Gattungen vor, von denen zwei nicht endemisch sind, nämlich die beiden auch in Afrika verbreiteten Gattungen Eugenia und Syzygium. Der einzige europäische Vertreter der Myrtengewächse, die mediterrane Myrte (Myrtus communis L.), von der sich der Familienname ableitet, gehört ebenfalls in diese Unterfamilie.2.1.2Unterfamilie LeptospermoideaeDie Unterfamilie Leptospermoideae umfaßt ebenfalls etwa 75 Gattungen, wovon über 70 Gattungen in Australasien, Ozeanien und Ostasien vorkommen. In Südamerika gibt es nur eine einzige Art (in Chile). Auch in Afrika ist diese Unterfamilie mit 2 Gattungen nur schwach repräsentiert. Betrachtet man die Anzahl an Arten, so ist diese Unterfamilie die artenreichere, wobei Eucalyptus die artenreichste Gattung darstellt. Die meisten der über 500 verschiedenen Arten sind in Australien endemisch. Die Gattung Melaleuca, mit etwa 230

A. Einleitung4

Arten nach Eucalyptus die zweitgrößte Gattung, hat ein größeres Verbreitungsgebiet, nämlich von Australien bis Neu Guinea, Neukaledonien und Südostasien. Eine weitere wichtige Gattung ist Leptospermum. Sie umfaßt 86 Arten, 81 endemisch in Australien. Eine Art dehnt sich bis nach Südostasien aus (L. amboinense), drei Arten sind dort endemisch (L. javanicum, L. parviflorum, und L. recurvum); eine Art, L. scoparium, ist weit verbreitet in Neuseeland. Sie gilt dort zur Zeit noch als häufigste, weitverbreitete Pflanze, mit weiterem natürlichen Vorkommen in Tasmanien. Auch die Gattung Kunzea, die etwa 40 Arten umfaßt, gehört zu dieser Unterfamilie.

Eine Gliederung dieser Unterfamilie in Triben ist zum jetzigen Zeitpunkt noch nicht erfolgt. Ebensowenig sind die einzelnen Gattungen, mit Ausnahme von Eucalyptus, in Untergattungen bzw. Sektionen eingeteilt.

Für eine genaue taxonomische Beschreibung sei auf die „Flora of Australia, Vol. 20, Myrtaceae, Melaleuca“ verwiesen, die sich in Bearbeitung befindet und in Kürze erscheinen wird (CRAVEN & LEPSCHI, 1999). Entsprechend der Klassifikation von BRIGGS & JOHNSON (1979) lassen sich einzelne Gattungen zu Gruppen zusammenfassen. Dabei findet sich die Gattung Melaleuca in einer anderen Gruppe als die beiden Gattungen Kunzea und Leptospermum, die eng verwandt sind.

CRAVEN (1999) unterteilt auch die Gattung Melaleuca in Gruppen. Die M. linariifolia-Gruppe umfaßt fünf Arten, die sich morphologisch und anatomisch stark ähneln,

u.a. M. alternifolia, M. dissitifloraund M. linariifolia s.str. Eine zweite Gruppe, die M. leucadendra-Gruppe, umfaßt mit 15 Arten die tropischen und subtropischen Melaleuca-Arten, die sogenannten „broad leaved paperbarks“. Letztere Gruppe gestaltet sich für Botaniker schwierig, da anatomische Ähnlichkeiten sowie eine starke Tendenz zur Hybridisierung innerhalb dieser Gruppe in der Vergangenheit immer wieder zu Verwechslungen führten. Zu den „broad leaved paperbarks“ zählen u.a. M. cajuputi,

M. quinquenervia, M. leucadendra s.str., und M. viridiflora. BLAKE (1968) publizierte eine grundlegende systematische Bearbeitung, die von BYRNES (1984, 1985, 1986) weitgehend übernommen wurde, jedoch vereinigte jener wiederum M. quinquenervia mit M. viridiflora auf Grund von Überschneidungen beim anatomischen Bestimmungsschlüssel. Auch lassen sich ältere Literaturangaben zu Inhaltsstoffen nicht immer den oben genannten Arten zuordnen. Im weiteren Verlauf der Arbeit richtet

sich die Nomenklatur nach der systematischen Bearbeitung von CRAVEN & LEPSCHI (1999).

2.2 Morphologie und Anatomie

Die Myrtengewächse sind Holzpflanzen (Bäume und Sträucher) mit meist immergrünen, gegenständigen, ganzrandigen, ledrigen Blättern. Die heterochlamydeischen, stets cyclischen Blüten sind pentamer oder tetramer. Der Fruchtknoten ist coenocarp-syncarp, meist unterständig, und häufig von einer röhrenförmig verlängerten Blütenachse umwachsen. Das Androeceum weist eine sekundär, zentripetale Vermehrung an Stamina

A. Einleitung

auf (Polyandrie). Die zahlreichen Staubblätter stehen frei (Kunzea) oder in Bündeln (Melaleuca). Ihre intensive Färbung erhöht die Schauwirkung der Blüten.

An Fruchtformen sind Kapsel-, Beeren-, oder Steinfrüchte anzutreffen. Die in dieser Arbeit besprochenen Gattungen bilden ausschließlich Kapselfrüchte aus, unterschiedlicher Größe und Form. Die zahlreichen Samen enthalten nur wenig oder kein Endosperm. Als anatomische Besonderheit sind bikollaterale Leitbündel (nicht bei Leptospermum scoparium) und die in verschiedenen Pflanzenteilen vorkommenden schizolysigenen Ölbehälter, die ätherisches Öl enthalten, erwähnenswert.

2.3 Chemische Merkmale

2.3.1Nicht flüchtige Inhaltsstoffe

An nicht flüchtigen Inhaltsstoffen sind Polyphenole und Gerbstoffe bei den Myrtaceae allgemein verbreitet. Bei den Gerbstoffen handelt es sich meist um Gallo- und Ellagtannine; an phenolischen Verbindungen kommen auch Anthocyanidine vor (LOWRY, 1976).

Methylierte Ellagsäuren werden als Familien- bzw. Ordnungsmerkmal aufgefaßt. Das Flavonoidspektrum umfaßt lipophile O- und C-methylierte Flavanone und Flavone. C-methylierte Flavone sind auch in den Cuticular- und Korkwachsen zu finden ebenso wie auch die Ursolsäure, die in Eucalyptus-, Leptospermum-, und Melaleuca-Arten auftritt (COURTNEY et al., 1983). Pentacyclische Triterpene wurden für Leptospermum scoparium beschrieben (HÄBERLEIN & TSCHIERSCH, 1994b).

Phloroglucinol-Derivate, acyliert +/o. alkyliert, sowie mehrkernige Phloroglucide vom Myrtucommulon-Typ sind weit verbreitet. Chemotaxonomische Studien werden auch geführt anhand von Untersuchungen an Prolin-Derivaten in Melaleuca-Arten (JONES et al., 1987; NAIDU et al., 1987), sowie mit Hilfe des Nachweises von Polyhydroxyalkaloiden (PORTER et al., 1999).

2.3.2 Flüchtige Inhaltsstoffe

Wegen der reichen Produktion an ätherischen Ölen haben viele Myrtaceen als Gewürz- und Heilpflanzen seit Jahrhunderten wirtschaftliche Bedeutung. Zu den bekannten Ätherisch-Öl-Gewächsen gehören Eucalyptus, Gewürznelke, Piment, Myrte und Teebaum. Während die Bezeichnungen Eucalyptusöl und Nelkenöl eindeutig sind, da ausschließlich Arten einer Gattung (Eucalyptus respektive Syzygium) zu deren Gewinnung Verwendung finden, so ist die Bezeichnung Teebaumöl diffus.

Der Name Teebaum wurde im Jahre 1770 vom Naturkundler Joseph Banks geprägt, der an der ersten Entdeckungsreise (1768-1771) von James Cook auf der „Endeavour“ teilnahm. In Ermangelung an echtem Tee (Camellia sinensis) braute sich die Mannschaft aus den Blättern der vorhandenen Sträucher ein

A. Einleitung

Ersatzgetränk. In der Folge wurden die dafür verwendeten Pflanzen Teebäume genannt. Zur Herstellung des Tees dienten die Blätter von Arten der Gattungen Baeckea, Kunzea, Leptospermum und Melaleuca. Der Begriff Teebaumöl wird somit im weiteren Sinne für die Beschreibung der ätherischen Öle von verschiedenen Arten dieser vier Gattungen der Myrtengewächse mit gänzlich unterschiedlicher Zusammensetzung verwendet. Teebaumöl im engeren Sinne definiert sich nach dem DAC, der unter Teebaumöl die an Terpinen-4-ol reichen Öle verschiedener Arten der Gattung Melaleuca versteht. In den Blattölen der Myrtaceae dominieren Mono- und Sesquiterpene; Phenylpropan-Derivate sind eher selten. Die Ausbildung chemischer Rassen ist stark ausgeprägt. Weniger Beachtung fand bis vor wenigen Jahren die Tatsache, daß in den ätherischen Ölen dieser Familie eine Reihe von cyclischen Polyketonen, sogenannte β-Triketone, vorkommen. Diese wurden u.a. für die Gattungen Eucalyptus, Leptospermum, und Melaleuca beschrieben (GHISALBERTI, 1996; BROPHY et al., 1996).

Pflanzenarten, deren ätherische Öle unter dem Namen Teebaumöle s.l. bekannt sind3.1 Leptospermum scoparium J. R. et G. Forst. Leptospermum scoparium J.R. et G. Forst. liefert Manukaöl. Der Gattungsname setzt sich aus den beiden griechischen Worten „leptos“ ( = schmal) und „sperma“ ( = Samen) zusammen und nimmt Bezug auf die zahlreichen schmalen Samen, die nach der Fruchtreife ausgestreut werden. Das Epitheton scoparium beschreibt das besenartige Aussehen der Zweige. Sonstige Bezeichnungen für diese Pflanze sind „red tea tree“ (ESLER & ASTRIDGE, 1974) und die bei den Maori gebräuchlichen Bezeichnungen „Manuka“ und „Kahikatoa“. Cave: Der letzte Name ist nicht zu verwechseln mit „Kahikatea“, dem Maori-Namen für Dacrycarpus dacrydioides (A. Rich.) De Laubenf. (BROOKER et al., 1987).

A. Einleitung

73.1.1 Morphologie und Anatomie

Eine botanische Beschreibung von L. scoparium kann wie folgt zusammengefaßt werden:Die Größe der ausdauernden, immergrünen Holzpflanze variiert von niederliegenden Büschen bis zu 12 m hohen Bäumen mit hohem Verzweigungsgrad. Die Rinde ist braun gefärbt und schält sich in langen faserigen Streifen. Artcharakteristisch sind die in der Regel weißen, 8-15 mm großen Einzelblüten, die sowohl achselständig als auch direkt an größeren Zweigen sitzend vorkommen. Die Blüte ist durch je einen Kreis aus je 5 freien, alternierend zueinander stehenden Sepalen (ca. 2 mm) und Petalen (4-7 mm) charakterisiert. Die sekundär-polyandrischen Stamina stehen in 5 Gruppen zu jeweils (5)-7-(9) Filamenten auf einem Kreis, superponiert zu den Kronblättern. Nach innen folgt ein fünfblättriges unterständiges Gynoeceum, das nach der Fruchtreife viele schmale, teilweise sterile, Samen aus einer fünffächrigen holzigen Kapsel freigibt. Entscheidend für die Abgrenzung der Art von anderen Leptospermum-Arten ist die stechende Spitze der ganzrandigen lineallanzettlichen bis eirunden Blätter. Letztere, wechselständig und sitzend, weisen eine Größe von 5-18 mm Länge und 2-4 mm Breite auf. Folgende anatomische Merkmale der Blätter lassen sich zur Unterscheidung von Kunzea ericoides heranziehen: Eine stark ausgeprägte Cuticula, ca. 10 μm dick, anomocytische Spaltöffnungen, kollaterale Leitbündel, altersabhängig eine stark ausgeprägte Sklerenchymkappe im Leitbündelbereich (JOHNSON, 1980).3.1.2VerbreitungDas Verbreitungsgebiet von Leptospermum scoparium ist in Abb.1 dargestellt. Die formenreiche Art kommt ubiquitär in Neuseeland vor und ist dort zugleich einziger Vertreter ihrer Gattung. Weitere natürliche Standorte liegen in Tasmanien, sowie vereinzelt in Südostaustralien. Auf der Nordinsel und in weiten Teilen der Südinsel Neuseelands ist

L. scoparium die dominierende Pflanzenart. Dies steht in engem Zusammenhang mit der Feuerrodung der Polynesier in den vergangenen Jahrhunderten und der Abholzung der verbliebenen Primärwälder in den letzten 200 Jahren. Insbesondere nach Waldbränden ist die Ausbreitung des Pyrophyten L. scoparium begünstigt. Auf den nährstoffarmen Böden besiedelt L. scoparium zusammen mit Kunzea ericoides weite Buschlandflächen. Das Verbreitungsgebiet von L. scoparium umfaßt klimatisch unterschiedliche Standorte von den Küsten, d.h. Meeresspiegelhöhe bis hin in alpine Regionen in Höhenbereichen von ca. 1600 m ü. NN (ESLER & ASTRIDGE, 1974).

Als Anpassung an diese unterschiedlichen Lebensräume haben sich verschiedene Ökotypen herausgebildet, die auf die jeweiligen Standorte spezialisiert sind und somit morphologisch und anatomisch unterschiedliche Merkmale aufweisen (RONGHUA et al., 1984; JOHNSON, 1980; PORTER et al., 1998).

A. Einleitung

Bemerkenswert ist die Anpassungsfähigkeit der Art, die ein Überleben an extremen Standorten, wie beispielsweise dem thermisch aktiven Gebiet von Rotorua ermöglicht.

3.1.3 Chemische Merkmale

Chemischer Polymorphismus, das Phänomen, daß Pflanzen einer Art unterschiedliche chemische Inhaltsstoffmuster aufweisen, ist im Pflanzenreich weit verbreitet.

Die Gattung Leptospermum ist in bezug auf Polychemismus in jüngster Zeit gut untersucht worden, insbesondere durch BROPHY et al. (1998a,b, 1999a,b,c, 2000a,b),

die ca. 70 Arten der australischen Ostküste untersuchten. Eine hohe Variabilität konnte für die gesamte Gattung festgestellt werden. In Neuseeland sind vier verschiedene Chemotypen für die Art L. scoparium von PORTER & WILKINS (1998) beschrieben worden. Sie unterscheiden in einen 1. Triketon-reichen-, 2. Linalool/Eudesmol-reichen, 3. Pinen-reichen, und 4. Triketon/Linalool/Eudesmol-armen Chemotyp.

Tabelle 1:Chemotypen von L. scoparium nach PORTER & WILKINS (1998), prozentuale AngabenChemotypαα-PinenLinaloolCalamenenδδ-Cadinen∑∑ Triketone∑∑ Eudesmole 1 "Manex"0.50.111.96.124.5nd2 "Kaiteriteri"1.24.38.03.2nd16.83 "Woodstock"63.03.01.90.6ndnd4 "Takaka Hill"2.3nd4.31.9nd5.9Abbildung 1: Verbreitung von L. scoparium (Manuka) im australasiatischen Raum

A. Einleitung

Kunzea ericoides (A. Rich.) J. Thompson

3.2.1 Morphologie und Anatomie

Eine botanische Beschreibung von K. ericoides kann wie folgt zusammengefaßt werden: Die Größe der ausdauernden, immergrünen Holzpflanze variiert von niederliegenden Büschen bis zu 16 m hohen Bäumen mit hohem Verzweigungsgrad. Die Rinde ist rotbraun gefärbt und schält sich in langen faserigen Streifen. Artcharakteristisch sind die in der Regel weißen, 3-7 mm großen Einzelblüten, die zu mehreren oder einzeln an den Spitzen der Zweige sitzend vorkommen. Die Blüte ist durch je einen Kreis aus je 5 freien, alternierend zueinander stehenden Sepalen und Petalen charakterisiert. Die sekundär-polyandrischen Stamina stehen in 5 Gruppen zu jeweils (5)-7-(9) Filamenten auf einem Kreis, superponiert zu den Kronblättern. Nach innen folgt ein drei- oder vierblättriges unterständiges Gynoeceum, das nach der Fruchtreife viele schmale, teilweise sterile, Samen aus einer drei- oder vierfächrigen holzigen Kapsel freigibt. Entscheidend für die Abgrenzung der Art von L. scoparium sind die weichen, nicht so stark punktierten Blätter. Diese sind wechselständig und sitzend angeordnet (BURROWS, 1996; STEWART, 1984). Weitere folgende anatomische Merkmale der Blätter lassen sich zur Unterscheidung von L. scoparium heranziehen: Eine weniger stark ausgeprägte Cuticula, ca. 4 μm dick, paracytische Spaltöffnungen, bikollaterale Leitbündel. (JOHNSON, 1980). Ein Blütenmerkmal erlaubt die Abgrenzung von Kunzea gegenüber Leptospermum: In der Gattung Kunzea sind die Filamente der Stamina bedeutend länger als die Petalen (HARRIS et al., 1992).3.2.2VerbreitungDie Art K. ericoides ist in Neuseeland weit verbreitet. Sie besiedelt als Pionierpflanze weite Landstriche und bildet scheinbar monospezifische Standorte. Häufig ist K. ericoides in Gesellschaft mit L. scoparium und Ulex europaeus anzutreffen, die es jedoch nach etwa 30 Jahren unterdrückt (ALLEN et al., 1992). Kanuka ist anspruchsvoller als Manuka. Sie wächst von Meereshöhe bis ca. 1000 m ü.NN, ist jedoch auf sehr feuchten oder sehr unfruchtbaren Böden nicht anzutreffen. Sie weist weiterhin eine geringere Salztoleranz auf (ESLER & ASTRIDGE, 1974). Diese Gründe führen zur Abwesenheit von Kanuka in Tasmanien und in

den neuseeländischen Regionen South Westland, Fiordland, Southland und Stewart Island (PERRY et al., 1997b)

Gattung Kunzea. Antivirale Acylphloroglucinol-Derivate wurden von BLOOR (1992) aus den Arten K. ericoides und K. sinclairii isoliert.

Für die ätherischen Öle der Art K. ericoides werden zwei Chemotypen postuliert. Man unterscheidet einen weit verbreiteten p-Cymen-armen Typ (< 5%), sowie einen

seltener anzutreffenden p-Cymen-reichen (5-30%). Beide Typen enthalten α-Pinen als Hauptkomponente, mit einem Gehalt von 40-80% (PERRY et al., 1997b)

M. alternifolia bevorzugt feuchte Standorte an Wasserläufen oder sumpfige Gebiete.

Melaleuca alternifolia Cheel liefert Australisches Teebaumöl. Der Gattungsname setzt sich aus den beiden griechischen Worten „melas“ ( = schwarz) und „leucos“

(= weiß) zusammen und nimmt damit Bezug auf den schwarzen Stamm, möglicherweise auch verkohlt durch Feuer, und die weiße Rinde der jüngeren Zweige. Das Epitheton alternifolia beschreibt die wechselständige Stellung der Blätter.

A. Einleitung

Bungawalbin B

Im Jahre 1989 wurde im Zusammenhang mit Teebaumölproduktion und –handel die ATTIA gegründet. Dabei handelt es sich um einen Zusammenschluß von Anbauern, Ölproduzenten, Anbietern, Einkäufern und Exporteuren. Die Aktivitäten der ATTIA haben dazu geführt, daß in Australien die Art M. alternifolia zum dominierenden Teebaum und die Teebaumölproduktion zu einem wichtigen Wirtschaftsfaktor avancierte. Inzwischen sind Plantagen von M. alternifolia auch in Indien, Simbabwe und Südafrika entstanden.

A. Einleitung13Tabelle 3:Chemotypen von M. alternifolia nach HOMER et al. (2000), prozentuale AngabenChemotyp1,8-CineolTerpinolenTerpinen-4-ol1 „Type"0-81-534-542 „Var D"10-2648-69< 53 „Var C"18-2818-2716-194 „Var A"24-440-216-205 „Var B"55-720-2< 6647-646-15< 43.3.4MonographienDAC, ISO-Norm und Australischer Standard lassen jeweils zwei weitere Melaleuca-Arten zur Teebaumöl-Gewinnung zu. Es handelt sich dabei um die ebenfalls Terpinen-4-ol-reiche Öle produzierenden Arten M. linariifolia und M. dissitiflora. Die frostharte Art M. linariifolia wächst wie M. alternifolia an der australischen Ostküste, während das Verbreitungsgebiet von M. dissitiflora im Landesinneren um Davenport und Alice Springs liegt.

3.4 Melaleuca cajuputi subsp. cajuputi Powell

Melaleuca cajuputi subsp. cajuputi Powell liefert Cajuputöl. Das Epitheton cajuputisetzt sich aus den beiden indonesischen Worten „kayu“ ( = Holz) und „putih“ ( = weiß) zusammen. Sonstige Bezeichnungen für diese Pflanze sind „cajeput tree“, „swamp tea tree“, sowie die malaiischen Bezeichnungen „Gelam“ und „kajoe poeti“

3.1.3 Chemische Merkmale

Chemischer Polymorphismus, das Phänomen, daß Pflanzen einer Art unterschiedliche chemische Inhaltsstoffmuster aufweisen, ist im Pflanzenreich weit verbreitet.

Die Gattung Leptospermum ist in Bezug auf Polychemismus in jüngster Zeit gut untersucht worden, insbesondere durch BROPHY et al. (1998a,b, 1999a,b,c, 2000a,b),

1. Triketon-reichen-,

2. Linalool/Eudesmol-reichen,

3. Pinen-reichen, und

4. Triketon/Linalool/Eudesmol-armen Chemotyp

3.2 Kunzea ericoides (A. Rich.) J. Thompson

3.2.1 Morphologie und Anatomie

Eine botanische Beschreibung von K. ericoides kann wie folgt zusammengefaßt werden: Die Größe der ausdauernden, immergrünen Holzpflanze variiert von niederliegenden Büschen bis zu 16 m hohen Bäumen mit hohem Verzweigungsgrad. Die Rinde ist rotbraun gefärbt und schält sich in langen faserigen Streifen. Artcharakteristisch sind die in der Regel weißen, 3-7 mm großen Einzelblüten, die zu mehreren oder einzeln an den Spitzen der Zweige sitzend vorkommen. Die Blüte ist durch je einen Kreis aus je 5 freien, alternierend zueinander stehenden Sepalen und Petalen charakterisiert. Die sekundär-polyandrischen Stamina stehen in 5 Gruppen zu jeweils (5)-7-(9) Filamenten auf einem Kreis, superponiert zu den Kronblättern. Nach innen folgt ein drei- oder vierblättriges unterständiges Gynoeceum, das nach der Fruchtreife viele schmale, teilweise sterile, Samen aus einer drei-oder vierfächrigen holzigen Kapsel freigibt. Entscheidend für die Abgrenzung der Art von L. scoparium sind die weichen, nicht so stark punktierten Blätter. Diese sind wechselständig und sitzend angeordnet (BURROWS, 1996; STEWART, 1984). Weitere folgende anatomische Merkmale der Blätter lassen sich zur Unterscheidung von L. scoparium heranziehen: Eine weniger stark ausgeprägte Cuticula, ca. 4 μm dick, paracytische Spaltöffnungen, bikollaterale Leitbündel. (JOHNSON, 1980). Ein Blütenmerkmal erlaubt die Kunzea ericoides (A. Rich.) J. Thompson liefert Kanukaöl. Traditionell wurden Manuka und Kanuka als Leptospermum-Arten gesehen, bis THOMPSON (1983) Kanuka auf Grund androeceischer Merkmale der Gattung Kunzea zuordnete (CONNOR & EDGAR, 1987). Letztere ist nach dem Leipziger Botaniker Gustav Kunze benannt. Das Epitheton ericoides beschreibt das Glockenheide-ähnliche Aussehen der Pflanze. Cave: Nicht zu verwechseln mit der Myrtenheide, einem Synonym für die Gattung Melaleuca. Sonstige Bezeichnungen für diese Pflanze sind „white tea tree“ (ESLER & ASTRIDGE, 1974) und die bei den Maori übliche Bezeichnung „Kanuka“.

Die Art K. ericoides ist in Neuseeland weit verbreitet. Sie besiedelt als Pionierpflanze weite Landstriche und bildet scheinbar monospezifische Standorte.

Häufig ist K. ericoides in Gesellschaft mit L. scoparium und Ulex europaeus anzutreffen, die es jedoch nach etwa 30 Jahren unterdrückt (ALLEN et al., 1992).

Kanuka ist anspruchsvoller als Manuka. Sie wächst von Meereshöhe bis ca. 1000 m ü.NN, ist jedoch auf sehr feuchten oder sehr unfruchtbaren Böden nicht anzutreffen.

Sie weist weiterhin eine geringere Salztoleranz auf (ESLER & ASTRIDGE, 1974). Diese Gründe führen zur Abwesenheit von Kanuka in Tasmanien und in den neuseeländischen Regionen South Westland, Fiordland, Southland und Stewart Island (PERRY et al., 1997b)

3.3Melaleuca alternifolia Cheel3.

3.1 Morphologie und Anatomie

Eine botanische Beschreibung von M. alternifolia findet sich in Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis (HARNISCHFEGER & REICHLING, 1998):

„Bis 7 m großer Baum mit buschiger Krone und papierähnlicher, weißlicher Rinde. Jungtriebe und Blütenstände gewöhnlich seidig behaart, ältere Zweige kahl.

Blätter gegenständig, spitz-lanzettlich, gerade bis leicht sichelförmig, 1.0-2.5 cm lang, mit deutlich erkennbaren Öldrüsen. Die Blüten geben die Erscheinung flauschiger weißer Massen. Sie stehen in Ähren, 3-5 cm lang, Kelchröhre rundlich bis eiförmig, 3-4 mm lang; kurze, breite Kelchzipfel; Blütenblätter etwa doppelt so groß. Die Staubblätterbündel um 2 cm lang, jedes mit vielen Filamenten und kleinen Antheren, klauenförmig auslaufend. Zahlreiche Samenanlagen in den Fruchtknoten; dicker Stempel mit kopfförmiger Narbe. Kapselfrucht zylindrisch, 3-4 mm im Durchmesser.“3.3.2VerbreitungDas Verbreitungszentrum der Wildbestände von M. alternifolia befindet sich im subtropischen Bereich Australiens zwischen dem 32. und 27. Breitengrad. Der kommerzielle Plantagenanbau erfolgt größtenteils im Norden von New South Wales im Bereich um das Melaleuca alternifolia Cheel liefert Australisches Teebaumöl. Der Gattungsname setzt sich aus den beiden griechischen Worten „melas“ ( = schwarz) und „leucos“ ( = weiß) zusammen und nimmt damit Bezug auf den schwarzen Stamm, möglicherweise auch verkohlt durch Feuer, und die weiße Rinde der jüngeren Zweige. Das Epitheton alternifoliabeschreibt die wechselständige Stellung der Blätter.

3.3.2 Verbreitung6

Das Verbreitungszentrum der Wildbestände von M. alternifolia befindet sich im subtropischen Bereich Australiens zwischen dem 32. und 27. Breitengrad. Der kommerzielle Plantagenanbau erfolgt größtenteils im Norden von New South Wales im Bereich um das Melaleuca alternifolia Cheel liefert Australisches Teebaumöl. Der Gattungsname setzt sich aus den beiden griechischen Worten „melas“ ( = schwarz) und „leucos“ ( = weiß) zusammen und nimmt damit Bezug auf den schwarzen Stamm, möglicherweise auch verkohlt durch Feuer, und die weiße Rinde der jüngeren Zweige. Das Epitheton alternifolia beschreibt die wechselständige Stellung der Blätter.

A. Einleitung

Bungawalbin Bassin, in den Regionen Casino, Grafton, Lismore, und erstreckt sich bis in den Süden von Queensland. M. alternifolia bevorzugt feuchte Standorte an Wasserläufen oder sumpfige Gebiete.

3.4 Melaleuca cajuputi subsp. cajuputi Powell Melaleuca cajuputi subsp. cajuputi Powell liefert Cajuputöl. Das Epitheton cajuputisetzt sich aus den beiden indonesischen Worten „kayu“ ( = Holz) und „putih“ ( = weiß) zusammen. Sonstige Bezeichnungen für diese Pflanze sind „cajeput tree“, „swamp tea tree“, sowie die malaiischen Bezeichnungen „Gelam“ und „kajoe poeti“

3.4.3MonographienIn Deutschland erstellte die Kommission E am BfArM 1993 eine Stoffcharakteristik für Cajuputöl. Als Stammpflanze wird fälschlicherweise

M. leucadendra angegeben. Dem Cajuputöl werden hier folgende pharmakologischen Eigenschaften zugesprochen: in vitro antibakteriell und hyperämisierend.

3.5 Melaleuca quinquenervia (Cav.) S. T. Blake

3.5.1 Morphologie und Anatomie

Eine botanische Beschreibung von M. quinquenervia findet sich in Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis (HARNISCHFEGER & REICHLING, 1998):

„Strauch oder bis 25 m hoher Baum mit stumpfgrüner bis gelblichgrüner Krone aus sich spreitenden nur wenig hängenden Zweigen. Die jungen Sprosse sind seidig behaart. Die Blätter sind glatt, die Blattstiele zusammengedrückt. 4-10 mm lang, die Blattspreite pergamentartig, steif, lanzettlich bis eiförmig auslaufend, sich von der Mitte zum

Stiel hin langsam verengend, 5-9 mm lang, 0.6-2.4 cm breit, mit in der Regel 5 Blattnerven, 0.30-0.45 mm breit, und nicht immer gut erkennbaren Drüsenflecken.

Die Blütenähren stehen terminal, manchmal 2-3 zusammen, 4.0-8.5 cm lang, 2.5-3.5 cm im Durchmesser, dicht mit Blüten besetzt. Die Blüten selbst sind fast immer weiß

bis cremefarben, manchmal grünlich, selten rot oder rötlich. Der Kelch ist 3-4 mm lang, die Kelchröhre zylinderförmig, faltig im trockenen Zustand, mit kurzen Haaren besetzt, manchmal auch kahl. Kelchblätter 1-2 mm lang und etwas breiter, dick und im unteren Teil mit Drüsen besetzt, mit breitem, narbigen und wimpernbesetztem Blattrand.

Die Blütenblätter sind spatel- bis eiförmig mit kurzer breiter Klaue, 3.0-3.5 mm lang, 2.0-2.5 mm breit, wimpernbesetzt mit 5 dünnen Nerven und linear Melaleuca quinquenervia (Cav.) S.6T. Blake liefert Niaouliöl. Das Epitheton quinquenervia beschreibt die fünf deutlich sichtbaren Longitudinalnerven der Blätter.

Sonstige Bezeichnungen für diese Pflanze sind „Belbowrie“, „broad leaved tea tree“, „paperbark tree“ und der in Frankreich verbreitete Name „Goménol“.

Auf der Insel Madagaskar sind vier weitere Namen lokal gebräuchlich: Oli, Ahambo, Kinindrano und Kinimbonaka.

3.6 Melaleuca viridiflora Sol. ex Gaertn.

3.6.1 Morphologie und Anatomie

Eine botanische Beschreibung von M. viridiflora findet sich in Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis (HARNISCHFEGER & REICHLING, 1998):

„Meist verkrüppelt wachsender, 3-7 m hoher Baum mit stumpfgrüner bis silbriger Krone und steifen, kurzen Zweigen. Junge Sprosse seidig behaart. Blätter, mit Ausnahme

der Stiele, glatt und unbehaart. Blattspreite dick und steif, langgezogen elliptisch oder eiförmig, lanzettartig auslaufend, in Richtung Stiel sich einengend, 5-10 cm lang oder länger, 2.5-6.0 cm breit, symmetrisch, 5-7 Blattnerven, 0.3-0.5 mm dick. Influoreszenz aus 1-3 endständigen Ähren, 7-10 cm lang, 4-6 cm im Durchmesser, dicht mit Blüten besetzt. Die Blüten selbst sind im allgemeinen von grünlichweißer, weißer oder grünlichgelber Farbe, häufig jedoch auch rot bis purpurfarben. Der Kelch ist 4.5-5.5 mm lang, seidig behaart, seltener glatt. Die Kelchröhre weitet sich nach oben, z. T. wird sie weiter als lang. Die Kelchblätter sind halbkreisförmig, mit Drüsen besetzt und in der Mitte innerviert mit breitem durchscheinenden Randstreifen, der in Wimpern an der Kante ausläuft. Die Blütenblätter sind ei- bis spatelförmig, mit kurzer breiter Klaue und 5-9 mehrfach verzweigten Blattnerven, linearen und elliptisch angeordneten Drüsenflecken, 4-5 mm lang, 3.0-4.5 mm breit. 8-10 Unter dem Namen Niaouliöl wird noch ein weiteres Öl gehandelt. Auch Melaleuca viridiflora Sol. ex Gaertn. liefert Niaouliöl. Das Epitheton viridiflora beschreibt die grünlichweiße bis grünlichgelbe Färbung der Blüten. Andere Bezeichnungen für diese Pflanze sind, wie auch bei M. quinquenervia, „broad leaved tea tree“ und „paper bark tree“.

B. Ergebnisse38Australischen Teebaumöls sind jeweils nur in Konzentrationen ≤1% nachweisbar. Neben den in Tab.10 aufgeführten Komponenten konnten des weiteren Camphen (4), Sabinen (6) und (Z)-β-Ocimen (14) in Spuren detektiert werden. Die Komponenten 19, 22, 27 und 39 erwiesen sich als Ester von kurzkettigen aliphatischen Alkoholen (Isoamylalkohol und 3-Methyl-3-buten-1-ol) mit Tiglinsäure bzw. Isovaleriansäure. Ein Vergleich der Zusammensetzung der untersuchten Handelsmuster erlaubt die folgenden Schlußfolgerungen:•17 der 18 untersuchten Muster lassen sich in zwei Kategorien einteilen.•13 Muster weisen eine hohe Konformität auf und verfügen über einen hohen Gehalt an β-Triketonen. (ξ=25.0%, xmin=21.9%, xmax=28.3%)•Vier Muster (002, 004, 007, 011/M) unterscheiden sich von den übrigen auf Grund eines geringeren β-Triketon-Gehalts (ξ=14.2%, xmin=11.6%, xmax=15.6%). Umgekehrt weisen diese Muster mit Ausnahme von 011/M einen höheren Gehalt an α-Pinen (1) auf (8-11% gegenüber 1.8%).•Vermutlich widerspiegeln sich in diesen Unterschieden regionale Variationen zwischen den beiden hauptsächlichen Produktionsorten East Cape (höherer Triketongehalt) und Coromandel Peninsula (niedrigerer Triketongehalt). Diese Tatsache stellt einen interessanten Aspekt der Qualitätskontrolle von Manukaöl dar.•Muster 018/M ist separat zu betrachten, da es sich wie oben beschrieben um eine angereicherte Fraktion des natürlichen Manukaöls handelt. Die Anreicherung bezüglich der β-Triketone ist jedoch marginal, sodaß dieses Muster keine besonderen Vorzüge im Vergleich zum natürlichen Öl aufweist und keinen höheren Einstandspreis rechtfertigt.

B. Ergebnisse39Abbildung 19:Gaschromatogramm von Probe 010/M (Manukaöl), J&W DB-Wax Etr, Peakzuordnung Tab.10

B. Ergebnisse442.2Kanukaöl Die GC- und GC-MS-Analysen der 11 Handelsöle zeigten ein Muster von etwa 50 verschiedenen Komponenten. 38 von ihnen konnten identifiziert werden, was zu einer Aufklärung der Öle von durchschnittlich 97% führte. Die quantitative Zusammensetzung der Öle ist in unkorrigierten Peakflächenprozenten angegeben und in Tab.11 aufgelistet. Das Chromatogramm eines repräsentativen Öls (028/K) zeigt Abb.20.Die Ergebnisse belegen eine hohe Konformität der untersuchten Kanukaöle. Der Anteil der Hauptkomponente α-Pinen (1) am Gesamtöl beträgt durchschnittlich 73.7%. Dementsprechend fallen Variationen im übrigen Komponentensprektrum nur wenig ins Gewicht. 13 weitere MTKW konnten detektiert werden. Unter diesen sind 1,8-Cineol (13, 4.0%) und p-Cymen (17, 3.5%) quantitativ die wichtigsten. Qualitativ kommt dem ox. MT (E)-Pinocarveol (56) eine charakterisierende Bedeutung zu, da diese Komponente, wenn auch mit einem geringen Prozentgehalt von durchschnittlich nur 0.4%, ausschließlich im Kanukaöl gefunden werden konnte.Betrachtet man allein die Präsenz der Komponenten in den beiden Handelsölen neuseeländischer Herkunft, Manuka- und Kanukaöl, so ist eine gute Übereinstimmung feststellbar. Eine Vielzahl an Komponenten, speziell im Bereich der STKW, sind beiden Ölen gemeinsam. Das Cadinan-Grundgerüst ist die vorherrschende Struktur der identifizierten STKW. Diese Komponenten sind im Kanukaöl jedoch nur in geringen Konzentrationen nachweisbar. Unter ihnen stellt (-)-trans-Calamenen (94, 1.3%) die wichtigste dar. Ebenso konnten die Ester Isoamylisovalerat (19) und Isoamyltiglat (27) in beiden Ölen gefunden werden.Charakteristisch für Kanukaöle ist das Muster der Sesquiterpenalkohole. Jeweils ausschließlich vier Komponenten,

Ledol (116), (E)-Nerolidol (117), Viridiflorol (126) und Spathulenol (131) konnten mit einem Prozentgehalt von ≥0.3% identifiziert werden. Abschließend läßt sich feststellen, daß Kanukaöl, welches ausnahmslos von aus Wildpflückung stammendem Pflanzenmaterial gewonnen wird, anhand der Konzentration seiner Hauptkomponente α-Pinen (1) klassifiziert werden kann. So unterschieden sich vier Muster (021, 023, 025, 027/K) von den übrigen auf Grund eines geringeren α-Pinen-Gehalts (ξ=68.0%, xmin=61.6%, xmax=71.0%) gegenüber der anderen Gruppe mit durchschnittlich 76.9%. Parallel dazu wiesen erstere Muster eine höhere Konzentration an ox. ST auf. Sie betrug 6% im Vergleich zu 3% bei den übrigen Mustern. Auch hier stellt sich die Frage, ob eine Korrelation zu regionalen Variationen in Neuseeland gegeben ist.

2.3Teebaumöl

Die GC- und GC-MS-Analysen der 39 Handelsöle zeigten ein Muster von etwa 50 verschiedenen Komponenten. 39 von ihnen konnten identifiziert werden, was zu einer Aufklärung der Öle von durchschnittlich 98% führte. Die quantitative Zusammensetzung der Öle ist in unkorrigierten Peakflächenprozenten angegeben und in Tab.12 aufgelistet. Das Chromatogramm eines repräsentativen Öls (045/T) zeigt Abb.21.Die Gewinnung von Australischem Teebaumöl, dem wirtschaftlich bedeutendsten der hier untersuchten Teebaumöle s.l., erfolgt nahezu ausnahmslos durch kommerziellen Plantagenanbau. So repräsentierte lediglich das Muster 037/T ein Öl, welches aus Wildwuchs gewonnen wurde. Internationale Standards fordern ein Höchstgehalt an 1,8-Cineol (13) von maximal 15% und ein Mindestgehalt an Terpinen-4-ol (47) von mindestens 30%. Die DAC-Monographie fordert zusätzlich prozentuale Spannbreiten für zwölf weitere Terpene. Diese regulativen Voraussetzungen führen zu einer hohen Konformität der Handelsmuster, was sich auch in diesen Untersuchungen widerspiegelt.

2.6 Weitere Teebaumöle s.l. des Handels Gemäß der Definition in Kap. A.2.3.2 läßt sich der Begriff Teebaumöl s.l. auf beliebig viele ätherische Öle der Myrtaceae ausdehnen. Gegenstand dieses Kapitels ist die Charakterisierung von vier weiteren Teebaumölen s.l. des Handels, die momentan (noch) keine Marktbedeutung haben. Untersucht wurden einerseits zwei Muster, welches eine künstliche Mischung aus einer speziellen Fraktion von Australischem Teebaumöl und der polaren Fraktion von Manukaöl darstellt, und andererseits je ein Muster der ätherischen Öle von Leptospermum petersonii, Melaleuca linariifolia und Melaleuca uncinata. Die quantitative Zusammensetzung der Öle ist in unkorrigierten Peakflächenprozenten angegeben und in Tab.16 aufgelistet.

Zwei weitere Komponenten wurden ausschließlich im Öl dieser Art detektiert. Dabei handelte es sich um das ox. MT Isopulegol (43, 2.5%) und um die aliphatische Verbindung 6-Methyl-5-hepten-2-on (21, 0.4%). Letztere stellt ein Intermediat in der Terpenbiosynthese dar und kommt in der Natur als Zerfallsprodukt von Terpenen vor. Für die chemotaxonomische Beurteilung der Gattung Leptospermum ist interessant, daß L. petersonii auch im Flavonoidspektrum kaum Übereinstimmungen zu L. scoparium zeigte (TSCHIERSCH, 1995).Das Chromatogramm des L. petersonii Öls zeigt Abb.27. Chemisch den Ölen wie Melisse, Petitgrain oder Lemongras nahestehend, stellt L. petersonii Öl unter sensorischen Gesichtspunkten eine Alternative im Bereich der Teebaumöle s.l. dar. Die geruchliche Akzeptanz von Teebaumöl war immer schon problematisch. Wie man einst hoffte, mitManukaöl eine geruchsneutrale Alternative zur Verfügung zu haben, so stellt die Lemon-Note des L. petersonii Öls eine sensorisch bekannte und vielfach geschätzte Alternative dar. Unter handelspolitischen Aspekten ist interessant, daß L. petersonii Öl bereits im EINECS unter der Nummer #285-372-4 registriert ist (FERGEUS, 2000).2.6.3Melaleuca linariifolia und Melaleuca uncinataDie ätherischen Öle von M. linariifolia (101/W) und M. uncinata (102/W) waren insofern interessant, als daß diese Arten wie auch die Art M. dissitiflora dafür bekannt sind, Terpinen-4-ol reiche chemische Varietäten hervorzubringen (BROPHY et al., 1989; BROPHY & LASSAK, 1992). Taxonomische Schwierigkeiten (vgl. Kap. A.2.1.2) und ausgeprägter Polychemismus lassen diese Arten jedoch problematisch erscheinen. Mehrere Chemotypen und Varietäten sind beschrieben (SOUTHWELL et al., 1992). Die DAC-Monographie läßt nur die Terpinen-4-ol reichen Varietäten der Arten linariifolia und dissitiflora als Stammpflanzen neben M. alternifolia zur Gewinnung von Teebaumöl zu.Die beiden hier zur Untersuchung gelangten Muster erfüllten die Anforderungen des DAC nicht. Beide Öle stellten einen 1,8-Cineol Chemotyp dar. Das ätherische Öl von M. linariifoliaenthielt 54.3% 1,8-Cineol (13), zusammen mit geringem Anteil an β-Phellandren (12). Weitere Komponenten in einer Konzentration >3.0% waren Limonen (11, 7.4%), γ-Terpinen (15, 4.0%), Terpinen-4-ol (47, 8.4%) und α-Terpineol (69, 6.7%). Noch eindrucksvoller stellten sich die Ergebnisse für das ätherische Öl von M. uncinata dar. Die Konzentration an 1,8-Cineol (13) betrug 78.0%. Daneben war lediglich eine weitere Komponente in einer Konzentration >3.0% detektierbar: α-Pinen (1, 4.8%). Dieses Muster entspricht somit dem Chemotyp 2 nach BROPHY (1999).

Zusammensetzung der ätherischen Öle gewonnen aus Pflanzenmaterial

4Mikrobiologische Untersuchungen von Teebaumölen s.l.4.1In vitro Testung ätherischer Öle – Einleitung

Zur Bestimmung der antimikrobiellen Eigenschaften von ätherischen Ölen und deren Komponenten existiert kein universelles Testsystem. Untersuchung und Evaluation der antimikrobiellen Aktivität von ätherischen Ölen gestaltet sich schwierig, weil es sich hierbei um komplexe Substanzgemische handelt. Bei der Wahl der Untersuchungsmethode müssen drei Probleme in Zusammenhang mit den physikalischen und chemischen Eigenschaften von ätherischen Ölen berücksichtigt werden:

1. Die Komplexität der Zusammensetzung erfordert genaue Angaben über das zu untersuchende Öl.

2. Die schlechte Wasserlöslichkeit der einzelnen Komponenten erfordert die Verwendung eines Tensids.

3. Die Flüchtigkeit der ätherischen Öl-Komponenten ist bei einer Inkubationstemperatur von 37°C, respektive 30°C erheblich verstärkt. Diesem Prozeß ist entgegenzuwirken. Die Methoden zur Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität lassen sich in zwei Kategorien einteilen. In solche zur Bestimmung, ob eine Testsubstanz das Wachstum eines Keimes hemmt, d. h. ob mikrobiostatische Eigenschaften vorliegen, und in solche, die bestimmen, ob die getesteten Keime abgetötet werden, d.h. ob mikrobiozide Eigenschaften vorliegen. Die Hemmung der Mikroorganismen kann mit Hilfe von Diffusions- oder Dilutions-Tests bestimmt werden. Dabei kann Agar oder Bouillon eingesetzt werden.

Agardiffusionstests sind einfach durchzuführen und wurden daher in der Vergangenheit vielfach eingesetzt. Ein Reservoir, das die zu testende Substanz bzw. Lösung enthält, wird in Kontakt mit einem keimbeladenen Nähragar gebracht. Als Reservoir dienen Testplättchen, Filterpapier oder Vorratszylinder. Nachteilig ist, daß große Variationsmöglichkeiten bezüglich der verwendeten Menge an Testsubstanz oder des Durchmessers des Reservoirs zu einer schlechten Vergleichbarkeit führen. Auch hängen die Ergebnisse letztlich von der Diffusionsrate der Testsubstanz(en) im Nähragar ab. Die geringe Wasserlöslichkeit der ätherischen Öl-Komponenten limitiert deren Diffusion durch den Agar und führt damit zu nicht reproduzierbaren Ergebnissen. Dies erklärt die schlechte Korrelation mit den MHK-Werten, die mit Hilfe eines Dilutionsverfahrens gewonnen werden. Ölkomponenten, die relativ gut wasserlöslich sind, wie beispielsweise 1,8-Cineol, α-Terpineol und Terpinen-4-ol, sind davon weniger betroffen als Kohlenwasserstoffe, die auf bzw. in dem Reservoir verbleiben oder sich während des Tests verflüchtigen (SOUTHWELL et al., 1993).

Bei der Untersuchung von hydrophilen Antibiotika stellen Agardiffusionstests eine komfortable, gut standardisierbare Methode dar, für die Testung von ätherischen Ölen

sind sie schlecht

B. Ergebnisse geeignet. Für Vorversuche (Screening) ist der Agardiffusionstest auch bei Ölen bedingt geeignet, für quantitative Aussagen jedoch gänzlich ungeeignet. Agardilutionsmethode

Die Agardilutionsmethode ist ein Verfahren, bei dem verschiedene Konzentrationen der Testsubstanz dem Agarmedium vor Einimpfung des Testkeimes zugesetzt werden. Dieses Verfahren hat zwei entscheidende Nachteile. Zum einen sind lipophile Verbindungen nur unzureichend mit dem Agar mischbar, so daß der Einsatz eines Tensids zwingend erforderlich ist, und zum anderen werden hohe Substanzmengen benötigt. Zur Herstellung einer einzigen Platte aus ca. 20 mL warmem, flüssigem Agar mit einem Gehalt von 0.5% (v/v) ätherischem Öl werden somit ca. 100 μL Substanz benötigt, pro Testkeim also mehrere mL. Deshalb eignet sich dieses Verfahren nur, wenn große Mengen einer Untersuchungssubstanz zur Verfügung stehen. BouillonverdünnungsmethodeDiese Testmethode ist auch als Reihenverdünnungstest bekannt. Auch hierfür

muß bei der Untersuchung lipophiler Substanzen ein geeignetes Tensid gefunden werden. Die ätherischen Öle werden im Nährmedium emulgiert und eine Verdünnungsreihe bekannter Konzentrationen hergestellt. Diese werden anschließend mit einer Suspension einer definierten Anzahl von Keimen beimpft. Nach Bebrüten läßt sich das Wachstum der Keime an einer Trübung erkennen; vice versa zeigt ein Ausbleiben der Trübung die wachstumshemmende Wirkung bei der entsprechenden Konzentration an.

Diese Methodik kann variiert werden. Sie kann im Mikromaßstab unter Verwendung von sogenannten Mikrotiterplatten aus klarem Polypropylen ebenso durchgeführt werden, wie im Makromaßstab unter Verwendung sterilisierter Reagenzgläser der Größe 13 x 100 mm. Bei Ermittlung des Testergebnisses mit bloßem Auge können Trübungen der

Öl-in-Wasser-Emulsion das Ablesen des Endpunktes erschweren. Hier können hilfsweise Farbindikatoren Verwendung finden, wie Fluoresceindiacetat (DELLAR et al., 1994) oder Triphenyltetrazoliumchlorid (CARSON et al., 1995b). Die auf diese Weise ermittelten MHK-Werte können jedoch leicht abweichen (CARSON & RILEY, 1994a).Die beiden Dilutionsmethoden eignen sich sowohl zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK-Wert), als auch zur Bestimmung der minimalen mikrobiziden Konzentration (MMK-Wert). Sie erfordern jedoch einen Kontakt von Keim und zu untersuchender Substanz von wenigstens 18 h und geben keine Aussage bezüglich der Abtötungsrate pro Zeiteinheit. So müssen für ätherische Öle, die zur Verwendung als Desinfektionsmittel und Antiseptika vorgesehen sind, weitere Testverfahren angewendet werden, da gute Desinfektionsmittel möglichst viele Arten von Mikroorganismen rasch,

B. Ergebnisse vollständig und dauerhaft inaktivieren sollten. Lethale Effekte werden bestimmt mit Hilfe des Rideal-Walker-Tests oder durch Bestimmung der log10-Reduktionsstufen. Durch solche Untersuchungen der Absterbekinetiken können dann vergleichende Aussagen getroffen werden zur mikrobioziden Aktivität ähnlich wirksamer Substanzen (COATES, 1988) oder ätherischer Öle mit vergleichbaren MHK-/MMK-Werten (LATTAOUI & TANTAOUI-ELARAKI, 1994).

4.2 In vitro Testung von Teebaumölen s.l. – Literaturübersicht

Das wirtschaftliche Interesse an Teebaumölen s.l. ist eng verknüpft mit deren antimikrobiellen Eigenschaften. Zur Bestimmung der keimhemmenden Eigenschaften von Teebaumölen s.l. wurden im letzten Jahrzehnt eine große Anzahl an Untersuchungen durchgeführt. In Tab.22 sind die mikrobiostatischen Eigenschaften anhand von Hemmhofgrößen oder MHK-Werten zusammengestellt. Dabei sind die eingesetzten Methoden, durchgeführten Untersuchungen und eingesetzten Tenside aufgelistet,

6sowie die untersuchten Objekte aus dem Bereich Teebaumöle s.l. des letzten Jahrzehnts. Die jeweils erzielten Ergebnisse sind schlecht vergleichbar, da die Methoden

zum Teil erheblich variierten, was an den unterschiedlichen Mengen an Testsubstanz bei den Agardiffusionstests besonders deutlich wird. Einige Versuche sind nicht reproduzierbar, da genaue Angaben zum verwendeten Öl oder zu den verwendeten Keimen fehlen. Deshalb wird dabei auf eine Aufstellung der erzielten Hemmhofdurchmesser und MHK-/MMK-Werte verzichtet. Die am häufigsten eingesetzten Tenside sind die nichtionischen Tween® 80 (Polyoxyethylen-20-Sorbitanmonooleat, Polysorbat 80) bei der Durchführung einer Bouillonverdünnungsmethode und Tween® 20 (Polyoxyethylen-20-Sorbitanmonolaurat, Polysorbat 20)

bei der Durchführung einer Agardilutionsmethode. Des weiteren finden Verwendung: Ethanol, Methanol, DMF (Dimethylformamid), DMSO (Dimethylsulfoxid) und

Triton X 100 (Iso-octylphenoxypolyethoxyethanol). Zur Stabilisierung der Emulsion kann auch Agar zugesetzt werden (MANN & MARKHAM, 1998).

Das am häufigsten zum Einsatz gebrachte Testöl ist das Australische Teebaumöl, gewonnen aus M. alternifolia. Dessen höchste Priorität wird zum einen an der Anzahl

an wissenschaftlichen Publikationen zu diesem Thema deutlich, als auch an der Jahresproduktion, welche im Erntezeitraum 1997/1998 350 t betrug. In der Tab.23 sind die

bei den in Tab.22 genannten Untersuchungen zum Einsatz gelangten Mikroorganismen aufgeführt. Betrachtet man die verwendeten Mikroorganismen, so wird deutlich,

daß sowohl unter humanpathogenen als auch unter morphologischen Gesichtspunkten ein großes Spektrum abgedeckt ist. Es fällt allerdings auf, daß nur wenige Taxa der Dermatophyten und Schimmelpilze untersucht wurden.

4.3.2 Materialien

Das Nährmedium, Agar oder Bouillon, stellt die unmittelbare Umgebung des Testkeimes dar und ist somit ein besonders wichtiger Faktor bei der Bestimmung der antimikrobiellen Aktivität. Die Bestandteile des Nährmediums können mit Öl-Bestandteilen reagieren und diese aktivieren oder inaktivieren. So ist es wahrscheinlich, daß die β-Triketone wie einige Aldehyde mit den Sulfhydrylgruppen in Proteinen reagieren. Die Nährmedien dürfen des weiteren keine Anteile an zweiwertigen Metallkationen aufweisen, da letztere zu einer Komplexbildung mit den β-Triketonen und mit Tetracyclinen führen würden. Dieser Tatsache war Rechnung zu tragen.

Mueller-Hinton Bouillon ist das empfohlene Medium für MHK-Wert-Bestimmungen von schnell wachsenden aeroben Mikroorganismen und wurde auch hier verwendet.

Für die Untersuchung von Corynebakterien wurde Hirn-Herz-Bouillon (BHIB) verwendet. Abweichend von den Empfehlungen des NCCLS wurde bei der Untersuchung

von Hefen, Dermatophyten und Schimmelpilzen Sabouraud-Dextrose-Bouillon verwendet. In jedem Fall betrug das Volumen an Bouillon für jede untersuchte Konzentration 5.0 mL. Der pH-Wert des hier verwendeten Mueller-Hinton-Mediums betrug 7.2 –7.4.

Der Wahl eines geeigneten Tensids kommt besondere Bedeutung zu, da es gilt, aus einer Reihe ungeeigneter Substanzen die am wenigsten ungeeigneten herauszufinden und einzusetzen gemäß des Leitsatzes: „Soviel wie nötig, sowenig wie möglich“. Tenside verändern die physiko-chemischen Eigenschaften des Testsystems. Sie können MHK-Werte erhöhen durch die Bildung von Mizellen und daraus resultierendem Einschluß von aktiven Komponenten, oder sie können MHK-Werte erniedrigen durch Veränderungen der Permeabilität der Zellwand der Mikroorganismen und daraus resultierender Erhöhung der Aktivität der aktiven Komponenten. Die am häufigsten zum Einsatz gebrachten Tenside sind die nichtionischen Tween® 80 und Tween® 20 (vgl. Tab.22). In der hier vorliegenden Arbeit wurde Tween® 80 in einer Konzentration

von 0.5% (v/v) verwendet.

4.3.3 Keime

Die Auswahl der Testkeime muß sich an einem möglichen Einsatzgebiet der Testsubstanz ausrichten, also innere oder äußere Anwendung, Einsatz als Antiseptikum oder als Desinfektionsmittel. Hilfestellung geben dabei auch bestehende Testvorschriften, wie beispielsweise der „preservative efficiency tests“ nach USP oder nach BP, der „TGA disinfectant test“ (GRAHAM, 1978) oder ganz allgemein die Empfehlungen der WHO oder des NCCLS. Die Angabe der Ausgangskeimzahl ist jeweils als obligat anzusehen, ebenso wie die Angabe der Stamm-Nummer, soweit ein definierter Stamm Verwendung findet.

B. Ergebnisse 103

Die Auswahl der zu verwendenden Mikroorganismen erfolgte unter humanpathogenen als auch unter morphologischen Gesichtspunkten, wobei ein möglichst großes Spektrum abgedeckt werden sollte. Dabei wurden fünf verschiedene Taxa von Mikroorganismen berücksichtigt. Zur Untersuchung gelangten vier Gram-negative und acht Gram-postive Bakterien, des weiteren eine Hefe, zwei Dermatophyten und zwei Schimmelpilze. Die 17 Mikroorganismen stellen größtenteils humanpathogene Keime dar, die Erkrankungen auslösen, für deren Behandlung ätherische Öle in der Vergangenheit eingesetzt worden sind. Unter den Gram-negativen Keimen findet sich Proteus vulgaris, für den Harnwegsinfektionen, septische Erkrankungen, Otitis und Abzesse beschrieben werden. Pseudomonas aeruginosa ist ein Naßkeim, der insbesondere bei immunsupprimierten Patienten in Krankenhäusern Pneumonien und weiterhin chronische Entzündungen des Mittelohrs und des Urogenitaltraktes auslöst. Escherichia coli verursacht sowohl intestinale Erkrankungen, wie Dyspepsie, Diarrhoe-Erkrankungen und ruhrähnliche Erkrankungen, als auch extraintestinale Infektionen, vor allem Erkrankungen von Organen mit Beziehungen zum Verdauungstrakt, z.B. Appendicitis, Cholecystitis und Harnwegsinfektionen. Moraxella catarrhalis stellt ein bekanntes Pathogen des Respirationstraktes dar. Von den acht untersuchten Gram-positiven Keimen gehören vier der Gattung Staphylococcus an. Staphylococcus aureus verursacht Eiterungen, Abzesse, chronische Sinusitis, Tonsillitis, Meningitis. Ein methicillin-resistentes klinisches Isolat dieser Art wurde ebenso ausgewählt, wie des weiteren die beiden koagulase negativen Arten

S. epidermidis und S. capitis. Enterococcus faecium und Bacillus subtilis vervollständigen das Spektrum der Gram-positiven Keime. Candida albicans ist für die Entstehung

von Candidiasis verantwortlich. Die Dermatophyten Epidermophyton floccosum und Trichophyton rubrum sind für Infektionen der Haut (Trichophytie) und Nägel (Onychomykose), seltener auch der Haare, bekannt. Des weiteren wurden zwei Schimmelpilze in die Untersuchungen einbezogen: Ein Vertreter der Gattung Aspergillus als Verursacher der Aspergillose bei abwehrgeschwächten Patienten und Penicillium notatum, der für die Entstehung von Keratitis (Entzündung der Cornea) und äußeren Infektionen der Ohren verantwortlich ist. Neben dem übergeordneten humanpathogenen Aspekt wurde die Auswahl auch nach morphologischen Gesichtspunkten durchgeführt. Neben den drei Vertretern beweglicher, Gram-negativer Stäbchenbakterien, stellt M. catarrhalis eine unbewegliche, plumpe Kokkenart dar, die meist in Diploform vorliegt. Staphylokokken sind unbewegliche, aerobe Kugelbakterien, die meist in Haufen vorliegen, wohingegen Enterococcus faecium eher eine

B. Ergebnisse104 kettenförmige Anordnung aufweist. Bacillus subtilis ist ein apathogenes, aerobes, meist bewegliches und sporenbildendes Stäbchenbakterium.

Die Gattung Corynebacterium umfaßt unbewegliche Stäbchenbakterien mit ein- oder beidseitiger keulenförmiger Anschwellung und ergänzt als fakultativ anaerober Vertreter somit sinnvoll das Spektrum der Gram-positiven Bakterien.

4.4 Verwendete Untersuchungsmaterialien

Die antimikrobielle Aktivität eines ätherischen Öls hängt von der Chemie des Öls ab. Deshalb müssen, um die Ergebnisse reproduzierbar zu gestalten, die verwendeten ätherischen Öle als Vielkomponentengemische chemisch genau beschrieben werden, d.h. es muß die prozentuale Zusammensetzung angegeben werden. Ist diese nicht

bekannt, so müssen zumindest Angaben vorliegen über die Stammpflanze, über die Herkunft, d. h. das Anbaugebiet, über den Erntezeitpunkt und über die weitere Aufarbeitung.

64.4.1 Ätherische Öle

Bei den hier zum Einsatz gebrachten Teebaumölen s.l. handelt es sich ausschließlich um Handelsmuster, die ab Frühjahr 1998 auf den deutschen Markt gelangten.

Folgende Öle kamen zum Einsatz:

4.4.3Lema®-ÖlLema®-Öl ist eine künstliche Mischung aus einer speziellen Fraktion von Australischem Teebaumöl und der polaren Fraktion von Manukaöl.

Lema®-Öl wurde aus der Überlegung heraus geschaffen, die positiven antimikrobiellen Eigenschaften der beiden natürlichen Öle zu kombinieren, um zum einen ein breiteres antimikrobielles Spektrum zu ermöglichen und zum anderen ein potenteres Produkt herzustellen. Lema®-Öl ist von der Firma Coast Biologicals Ltd. im November 1998 unter dem Titel „Improvements in and relating to antimicrobial compositions“ und der Nummer 332694 in Neuseeland zum Patent angemeldet worden. Gleichzeitig ist jedoch keine Registrierung im EINECS / ELINCS beantragt worden, was die Voraussetzung für die Verkehrsfähigkeit eines ätherischen Öls in den Mitgliedsstaaten der EU darstellt.

Eine Handelsfähigkeit dieses Öls ist somit nicht gegeben. Das hier zum Einsatz gebrachte Warenmuster trägt die interne Nummer 098/W. Die relative Dichte von Lema®-Öl beträgt 0.92-0.94 und deutet somit darauf hin, daß es sich hierbei nicht um eine 1:1-Mischung der Fraktionen von beiden Ölen handeln kann, denn die relative Dichte für Teebaumöl beträgt 0.895-0.905, die für Manukaöl 0.97-0.99. Die optischen und sensorischen Eigenschaften entsprechen eher dem Manukaöl.4.5Vergleichende mikrobiostatische UntersuchungenDie hier zur Untersuchung gelangten Öle tragen die Referenznummern 001/M (für die Isolierung der β-Triketone), 010/M, 027/K, 050/T, 077/C und 092/N.

Ergebnisse der mikrobiostatischen Untersuchungen sind in den Tab.27, 28 vergleichend zusammengestellt. Eine Interpretation der Zahlenwerte führte zu folgender Beurteilung: Teebaumöl zeigte eine gute antimikrobielle Aktivität, indem 13 der 16 untersuchten Mikroorganismen einen MHK-Wert von 0.20–0.45% zeigten. Wie die meisten ätherischen Öle (JANSSEN et al., 1987) erwies sich auch Teebaumöl als schlecht wirksam gegenüber Pseudomonas aeruginosa (1.00%). Es unterschied sich jedoch von den anderen untersuchten Ölen durch eine stärkere Wirksamkeit gegenüber den weiteren Gram-negativen Keimen. Im Vergleich zu Manukaöl war es schwächer wirksam gegenüber den beiden untersuchten Dermatophyten (0.60% bzw. 0.70%). Der vergleichsweise gute Effekt auf Candida albicans war in guter Übereinstimmung mit den Ergebnissen von HAMMER et al. (1998).

Cajuput- und Niaouliöl, die sich beide durch einen hohen Gehalt an 1,8-Cineol (13) auszeichnen, ähnelten sich auch in ihren MHK-Werten. Die wachstumshemmenden

6Effekte auf Gram-positive Bakterien (0.20–0.40%) waren vergleichbar mit denen vom Teebaumöl. Ebenso konnte festgestellt werden, daß im Bereich der Pilze nur

marginale Unterschiede zwischen den Aktivitäten der ätherischen Öle der drei Melaleuca-Arten vorliegen.Kanukaöl zeigte, wie alle untersuchten Öle, gute antimikrobielle Aktivität gegen Gram-positive Bakterien (0.20–0.30%). Es war jedoch wenig bzw. nicht wirksam gegenüber allen übrigen Arten von Mikroorganismen.

Manukaöl wies die höchste Selektivität zwischen den verschiedenen mikrobiellen Taxa auf. Besonders beachtenswert ist dessen hohe Wirksamkeit gegen Gram-positive Bakterien (0.05–0.15%) und gegen Dermatophyten (0.30–0.40%). Es erwies sich jedoch gleichzeitig als unwirksam gegenüber Candida albicans und den Schimmelpilzen (>2.00%). Durch den hohen wachstumshemmenden Effekt gegenüber Gram-positiven Bakterien unterschied es sich von allen anderen Teebaumölen s.l., wohingegen ähnliche Ergebnisse erzielt wurden, einerseits verglichen mit Teebaumöl, was die Wirksamkeit gegenüber Proteus vulgaris.

B. Ergebnisse108Tabelle 27:Antibakterielle Aktivität von Teebaumölen s.l., ββ-Triketon-Komplex und αα-TerpineolMHK [% (v/v)]KeimTeebaumCajuputNiaouliKanukaManukaββ-Triketon-Komplexαα-TerpineolGram-negative Bakterien:AProteus vulgaris0.300.450.45>2.000.500.320.16BPseudomonas aeruginosa1.001.901.90>2.000.850.320.32CEscherichia coli0.250.400.40>2.00>2.000.320.16Gram-positive Bakterien:EStaphylococcus aureus0.250.200.200.250.100.010.16FStaphylococcus aureus (MRSA)0.350.300.300.200.050.010.32GStaphylococcus capitis0.350.350.350.200.050.010.16HStaphylococcus epidermidis0.450.400.400.250.050.010.32I6

Enterococcus faecium0.250.200.200.250.050.010.04JBacillus subtilis0.300.200.200.300.150.020.16KCorynebacterium diphtheriae0.200.300.250.250.050.020.08LCorynebacterium minutissimus0.200.300.250.300.050.040.32Tabelle 28:Antifungale Aktivität von Teebaumölen s.l., ββ-Triketon-Komplex und αα-TerpineolMHK [% (v/v)]KeimTeebaumCajuputNiaouliKanukaManukaββ-Triketon-Komplexαα-TerpineolHefen:MCandida albicans0.300.400.40>2.00>2.000.040.16Dermatophyten:NEpidermophyton floccosum0.700.600.601.100.400.320.08OTrichophyton rubrum0.600.600.601.100.300.320.08Schimmelpilze:PPenicillium notatum0.300.400.40>2.00>2.00>2.000.16QAspergillus niger0.400.400.40>2.00>2.00>2.000.16(0.50%) und Pseudomonas aeruginosa (0.85%) betrifft, und andererseits verglichen mit Kanukaöl, was die Unwirksamkeit gegenüber Escherichia coli (>2.00%) betrifft.Der β-Triketon-Komplex, d. h. die Mischung aus Flaveson, Isoleptospermon und Leptospermon, zeigte eine hohe Aktivität gegenüber allen Mikroorganismen (0.01–0.32%) mit Ausnahme der Schimmelpilze (>2.00%). Der wachstumshemmende Effekt auf Gram-positive Bakterien war hoch (0.01–0.04%) und zugleich stärker als der des Manukaöls.

6Berücksichtigt man die Tatsache, daß ätherische Öle im Allgemeinen einen guten, jedoch unspezifischen Effekt gegenüber Gram-positiven Bakterien zeigen, so ist doch der auffallend hohe hemmende Effekt des Manukaöls beachtenswert. Wie aus unseren Ergebnissen, und denen von anderen (PERRY et al., 1997a; PORTER & WILKINS, 1998) hergeleitet werden kann, ist dieser Effekt hervorgerufen durch den β-Triketon-Gehalt. Das gleiche Wirkprinzip

wurde für die Extrakte von Helichrysum caespititium (Asteraceae) (DEKKER et al., 1983), Humulus lupulus (Cannabaceae) (LANGEZAAL et al., 1992) und Hypericum perforatum(Hypericaceae) (SCHEMPP et al., 1999) gefunden, die Caespitin respektive Humulon und Lupulon respektive Hyperforin enthalten. Diese vier Substanzen sind, wie auch die β-Triketone im Manukaöl, Phloroglucinol-Derivate Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die drei Teebaumöle s.l., gewonnen aus Melaleuca-Arten, über ein vergleichbares Aktivitätsmuster verfügen. Dennoch ist dem Australischen Teebaumöl den Vorzug zu geben, weil es eine stärkere Aktivität gegenüber Gram-negativen Keimen aufweist. Terpinen-4-ol (47) wird als die verantwortliche Komponente angesehen (SOUTHWELL et al., 1993). Der Gebrauch von Kanukaöl, welches sich das schwächste Teebaumöl s.l. herausstellte, ist zu antimikrobiellen Zwecken nicht angezeigt. Für Manukaöl muß anhand dieser Ergebnisse ein hoher β-Triketon Gehalt gefordert werden. Diese Öle werden gebildet von dem L. scoparium Chemotyp, dessen Verbreitungsgebiet in der East Cape Region von Neuseeland liegt.4.6Absterbekinetik von Staphylococcus aureusDie Untersuchung der Inaktivierungskinetik von Staphylococcus aureus gegenüber Teebaumölen s.l. sowie gegenüber dem isolierten β-Triketon-Komplex soll im Detail Auskunft geben über das Ausmaß der Aktivität gegenüber Bakterien. Es erschien sinnvoll, in diese Untersuchungen Lema®-Öl wegen denkbarer synergistischer Effekte mit einzubeziehen. Obwohl eine ausgezeichnete bakteriostatische Aktivität von Teebaumölen s.l. gegen Gram-positive Bakterien zuvor in vitro bewiesen wurde (CHRISTOPH et al., 2000), erfordert deren Anwendung als Antiseptika und Desinfektika das Wissen über deren bakterizide Aktivität (MARKHAM, 1999). Die Bestimmung der Absterbekinetik rechtfertigt eine Unterscheidung zwischen mikrobiostatischen und mikrobioziden Effekten und erlaubt des weiteren einen differenzierteren Vergleich der antimikrobiellen Aktivitäten dieser Teebaumöle s.l. (LATTAOUI & TANTAOUI-ELARAKI, 1994).Die hier zur Untersuchung gelangten Öle tragen die Referenznummern 001/M (für die Isolierung der β-Triketone), 011/M, 028/K, 052/T, 072/C, 087/N und 098/W. Ihre chemische Zusammensetzung ist Die bakterizide Aktivität der Öle ist in Tab.30 vergleichend dargestellt.

Nach 240 min erreichten vier Öle, nämlich Teebaum-, Cajuput-, Niaouli-, und Lema®-Öl, eine komplette Abtötung von 6.8 log10 Reduktionsstufen bei Konzentrationen von 2% und 1%. Die bakteriziden Effekte dieser Öle manifestierten sich deutlich durch das rasche Abtöten während der initialen Aussetzungsphase, welches deutlich in den Kurven der Absterbekinetik sichtbar wird (Abb.30, 31). Diese zeigen einen abrupten Abfall der lebenden Zellen innerhalb von 30 min.

Die Kurven für die niedrigeren Ölkonzentrationen (0.5% und 0.25%; Abb.32, 33) belegen, daß die bakteriziden Effekte streng konzentrationsabhängig sind. Außerdem erlaubt ein Vergleich der Kurven der Absterbekinetik, aufgenommen für vier verschiedene Konzentrationen, eine Quantifizierung der bakteriziden Effekte: Unter den Melaleuca-Ölen, Teebaum, Cajuput, und Niaouli, zeigte das letzte die höchste Aktivität, gefolgt von Teebaum und Cajuput. Bei allen untersuchten Ölkonzentrationen verliefen die Kurven der Absterbekinetik dieser drei Öle parallel. Lema®-Öl verhielt sich hierzu jedoch anders: Dessen Kurve ähnelte der von Teebaumöl mit einem vergleichbaren Abfall zu Beginn der Untersuchungsperiode. Nach 30 min (2%, 1%) bzw. 60 min (0.5%) entwickelte es jedoch einen stärkeren bakteriziden Effekt als die drei Melaleuca-Öle. Selbst bei einer schwächeren Konzentration von 0.5% erreichte es eine komplette Abtötung nach 120 min, welches die anderen drei Öle nicht vermochten.Eine Analyse der Daten für Kanuka- und Manukaöl, sowie für den β-Triketon-Komplex, macht deutlich, daß ihnen bakterizide Effekte nicht zugeschrieben werden können. Diese drei Proben zeigten nach 1 h keine abtötenden Effekte bei Testkonzentrationen von 2% und 1%. Manukaöl und die isolierten β-Triketone nicht einmal nach 2 h. Dieses Ergebnis zeigt sich ebenso deutlich in den vier graphischen Darstellungen der Kurven, die parallel zur x-Achse auf einem hohen Niveau verlaufen. Selbst die schwache Abnahme gegen Ende der Untersuchungszeit kann nicht mit bakteriziden Effekten erklärt werden, was durch Langzeitversuche über 24 h bestätigt wurde (vgl. Abb.34).Die Ergebnisse der Absterbekinetik bewiesen, daß die Melaleuca-Öle (Teebaum, Cajuput, Niaouli) absolut bakterizid wirksam sind, denn sie töten die untersuchten Keime auch während der stationären Phase. Überraschender Weise zeigten die anderen Öle, also Kanuka- und Manukaöl, und ebenso der β-Triketon-Komplex, das aktive Prinzip von Manukaöl, keinerlei bakterizide Eigenschaften, obwohl sie ebenfalls niedrige MHK-Werte aufweisen. Diese niedrigen MHK-Werte gegen Gram-positive Bakterien können somit als bakteriostatische Effekte gedeutet werden.Eine Kombination antibakteriell wirksamer Substanzen kann verschiedene Konsequenzen haben:

•Addition: Die Wirkung beider Komponenten addiert sich.

•Synergismus: Die Wirkung der Kombination ist signifikant höher als die Summe der Wirkungen der Einzelkomponenten.

•Indifferenz: Die Kombination ist nicht wirksamer als die wirksamste Einzelkomponente.•Antagonismus: Die Wirkung der Kombination ist geringer als die Wirkung der effektiveren Einzelkomponente. 6

Zwischen der Gruppe der absolut bakterizid wirksamen Substanzen und der Gruppe der bakteriostatisch wirksamen Substanzen besteht Synergismus oder Indifferenz (LEGLER, 1995). Tatsächlich zeigt Lema®-Öl, die künstliche Mischung einer Fraktion aus Australischem Teebaumöl und der polaren Fraktion von Manukaöl, synergistische Effekte, die sich durch höhere bakterizide Effekte der Mischung zeigen, im Vergleich zum reinen Teebaumöl. Dieses kann von der Absterbekinetik bei allen vier untersuchten Konzentrationen hergeleitet werden 4.7Antibakterielle Aktivität von ββ-Triketon-haltigen ÖlmischungenTeebaumöle s.l. werden seit dem letzten Jahrzehnt wieder verstärkt als antimikrobielle Substanzgemische eingesetzt. Für die drei Öle, die aus Melaleuca-Arten gewonnen werden, also Teebaum-, Cajuput- und Niaouliöl, konnte eine bakterizide Wirkung aufgezeigt werden (CHRISTOPH et al., 2001a). Diese Öle stellen komplexe Substanzgemische dar. Einige Inhaltsstoffe dieser Öle zeigen eine gewisse antimikrobielle Wirksamkeit, woraus sich ableiten läßt, daß nicht nur eine einzelne Komponente für diese Aktivität verantwortlich ist (CARSON & RILEY, 1995).

In dieser Hinsicht konzentriert sich das Interesse hier auf drei oxygenierte Monoterpene:•1,8-Cineol, Hauptkomponente in Niaouli- und Cajuputöl•α-Terpineol, ein gemeinsamer Inhaltsstoff dieser Öle, dessen hoher Beitrag zur antimikrobiellen Wirksamkeit zuvor deutlich herausgestellt wurde (GRIFFIN et al., 1999b)•Terpinen-4-ol, Hauptkomponente in Teebaumöl Manukaöl, der neuseeländische Gegenspieler zum Australischen Teebaumöl, zeigte gute bakteriostatische Eigenschaften, hervorgerufen durch einen hohen Anteil an β-Triketonen (Kap. B.4.5). Unser Ziel war es, die gegenseitige Beeinflussung zwischen den β-Triketonen und den Terpenoiden in vitro zu untersuchen.In Deutschland ist ein sekretomukolytisch wirksames Phytotherapeutikum „Myrtol standardisiert“ unter dem Handelsnamen Gelomyrtol® als OTC-Präparat zur Behandlung der akuten und chronischen Bronchitis und Sinusitis gut etabliert. Der therapeutische Nutzen ist in wissenschaftlichen Untersuchungen dargestellt (FEDERSPIL et al., 1997; MEISTER et al., 1999). Myrtol ist eine spezielle Fraktion des Destillats aus Myrtus communis L. und stellt eine terpenoide Mischung aus α-Pinen, (R)-(+)-Limonen und 1,8-Cineol dar. Eine Kombination von Myrtol mit dem Antibiotikum Oxytetracyclin-hydrochlorid ist ebenfalls im Handel und als verschreibungspflichtiges Arzneimittel zur Behandlung von Infektionen des unteren Respirationstraktes vorgesehen.Die Untersuchung verschiedener Mischungen von Teebaum- bzw. Niaouliöl mit β-Triketonen erfolgte aus der Überlegung heraus, Myrtol gegen die Teebaumöle s.l. auszutauschen, respektive Tetracyclin durch Triketone zu ersetzen. Auf die Gemeinsamkeiten der beiden letzten Substanzgruppen ist im vorangegangenen Kapitel ausführlich eingegangen worden. Phloroglucinol-Derivate, wie die β-Triketone, zeigen antifungale (KIM & RHEE, 1999), antimikrobielle (PERRY et al., 1997a; PORTER & WILKINS, 1998; MATHEKGA et al., 2000; WINKELMANN et al., 2000), anti-HIV (BOKESCH et al., 1999), herbizide (LEE et al., 1997) und insektizide (KHAMBAY et al., 1999) Aktivität.Die MHK- und MBK-Werte von jeder Substanz bzw. Mischung wurden mit Hilfe einer Makrobouillonverdünnungsmethode bestimmt. M. catarrhalis wurde in diese Untersuchung einbezogen, da es ein bekanntes Pathogen bei Infektionen des Respirationstraktes darstellt und in der Regel gegen Tetracycline empfindlich ist (BROWN et al., 1989). Des weiteren wurden die Mischungen und reinen Komponenten in Hinblick auf eine bakterizide Aktivität gegen S. aureus in Kurzzeit (4 h)-Abtötungsstudien untersucht.

B. Ergebnisse1184.7.1Getestete Mischungen

Die Empfindlichkeit von Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coliund Moraxella catarrhalis wurde gegen vier verschiedene Mischungen (Zusammensetzung s. Tab.31, 32) und gegen die Ölkomponenten β-Triketon-Komplex, 1,8-Cineol, α-Terpineol und Terpinen-4-ol getestet. Die zur Herstellung der Mischungen A und B genutzten Öle tragen die Referenznummern 001/M (für die Isolierung der β-Triketone), 043/T und 097/N.

4.7.2 Ergebnisse6

Die MHK- und MBK-Werte der Mischungen A-D, des β-Triketon-Komplexes und der drei untersuchten Terpene sind Tab.33 zu entnehmen. Mischung A und B zeigten eine hohe antimikrobielle Aktivität gegen S. aureus und M. catarrhalis und eine schwächere Aktivität gegen P. aeruginosa und E. coli. Die beiden Mischungen übertrafen die Effektivität von nachgestelltem Myrtol (Mischung C). Letztere erwies sich als unwirksam gegen P. aeruginosa und E. coli. Wie erwartet werden konnte, zeigte die Mischung D, die das Antibiotikum enthält, die höchste Aktivität. Die Hemmwirkung war zwei bis drei Zehnerpotenzen höher als bei den Mischungen A und B.Zwischen den drei untersuchten Monoterpenen waren nur marginale Unterschiede feststellbar. α-Terpineol und Terpinen-4-ol zeigten leicht stärkere Aktivität als 1,8-Cineol. Diese Ergebnisse waren in guter Übereinstimmung mit denen von CARSON & RILEY (1995).

Die Empfindlichkeit der vier Keime gegenüber dem β-Triketon-Komplex war unterschiedlich. Während einerseits ausgezeichnete hemmende Effekte gegen S. aureus

und M. catarrhalis beobachtet werden konnten, so zeigten sich andererseits nur schwache Effekte gegenüber P. aeruginosa und E. coli. Letztere wurden auch bei den

höchsten Untersuchungskonzentrationen nicht im Wachstum gehemmt.Aus den Ergebnissen der Tab.33 kann geschlossen werden, daß Zumischungen von β-Triketonen

zu Australischem Teebaumöl (Mischung A) den inhibitorischen Effekt von Terpinen-4-ol (bis zu 40% im Originalöl enthalten) von 0.16 (S. aureus) und 0.04 (M. catarrhalis)

auf 0.02 bzw. 0.01 erhöhen. Zumischungen zu Niaouliöl (Mischung B) erhöhen den inhibitorischen Effekt von 1,8-Cineol (bis zu 60% im Originalöl enthalten) von 0.16 (S. aureus) und 0.08 (M. catarrhalis) ebenfalls auf 0.02 bzw. 0.01. Die Werte der Tab.33belegen, daß es sich hier um additive Effekte handelt. Diese Verbesserungen werden hervorgerufen durch die vergleichsweise hohen inhibitorischen Effekte des β-Triketon-Komplexes, welche 0.01 und 0.005 betragen. Diese hier beschriebenen Effekte konnten bei den Keimen P. aeruginosa und E. coli nicht beobachtet werden, wie nach vorangegangenen Überlegungen zu erwarten war.Die Erhöhung des MBK-Wertes für S. aureus um eine Verdünnungsstufe im Vergleich von Mischung A mit Terpinen-4-ol ist im Hinblick auf die signifikante Erniedrigung des MHK-Wertes als Methodenfehler zu interpretieren.

Die bakterizide Aktivität ist in den Abb.35-38 dargestellt. Nach 240 min erreichen sowohl die Mischungen A und B als auch die drei Monoterpene eine komplette Abtötung von 6.8 log10Reduktionsstufen bei beiden untersuchten Konzentrationen. Unter den Terpenen zeigten die beiden Alkohole α-Terpineol und Terpinen-4-ol hohe bakterizide Wirkung, die in einer vollständigen Abtötung nach 5 min resultierte. Dies wird bereits durch Tab.33 offenkundig. Sie zeigen weitgehende Übereinstimmung zwischen den MHK- und MBK-Werten bei allen untersuchten Bakterien.Die Mischungen C und D als auch der β-Triketon-Komplex erreichten keine nennenswerte Verringerung der Keimzahl. Nach 60 min konnten keine lethalen Effekte festgestellt werden (log10 Reduktion: 0-0.2; vgl. Tab.34). Die Kurve der Absterbekinetik für den β-Triketon-Komplex verlief parallel zur X-Achse auf einem hohen Niveau, was bakteriostatische Aktivität deutlich macht. Ein ähnlicher Verlauf wurde für die Kurven der Mischungen C und D festgestellt mit schwachem Abknicken der Kurve von Mischung C und einem stärkeren Abknicken der Kurve von Mischung D nach 120 min, jeweils verursacht durch den Terpenoid-Anteil in den Mischungen.Die Kurven der Absterbekinetik verursacht durch die Mischungen A und B zeigen bei beiden Konzentrationen eine starke Verringerung an lebenden Zellen innerhalb von 60 min an. Mischung A zeigt dabei stärkere bakterizide Effekte. Des weiteren kann den Abb.35, 36entnommen werden, daß die Absterbekinetik dieser Mischungen in dem untersuchten Bereich nicht konzentrationsabhängig ist. Dies ist ein Ergebnis der Verdünnung der ätherischen Öle mit dem bakteriostatisch wirksamen β-Triketon-Komplex, welches naturgemäß stärkere Konsequenzen für Niaouliöl hat als für Teebaumöl, dessen Hauptkomponente Terpinen-4-ol das stärker bakterizid wirksame Monoterpen ist. Außerdem ist es nach den Abb.35, 38 offentsichtlich, daß Terpinen-4-ol in einer Konzentration von 1% eine komplette Abtötung innerhalb von 5 min verursacht, wohingegen die Mischung A in einer Konzentration von 2% 2 h benötigt, um die gleiche komplette Abtötung zu erzielen. Diese Tatsache läßt sich dadurch erklären, daß 2% der Mischung A weniger als die Hälfte an Terpinen-4-ol enthält, als die 1%ige Terpinen-4-ol-Untersuchungslsg., und ebenfallsdadurch, daß Mischung A, die 50% β-Triketone enthält, langsamer abtötet als Terpinen-4-ol.

Im Hinblick auf die Frage, ob β-Triketone die antimikrobielle Aktivität von terpenreichen ätherischen Ölen aus der Familie der Myrtaceen erhöhen, und daher vorteilshaft sind gegenüber anderen Präparaten, wie beispielsweise reinem Eukalyptusöl oder Myrtol, zeigen diese Untersuchungen, daß Teebaum- und Niaouliöl in Mischung mit dem β-Triketon-Komplex sich gleichwertig sind. Neben einer vorausgesetzten sekretolytischen Aktivität zeigen die Mischungen eine hohe antimikrobielle Aktivität, dokumentiert durch niedrige MHK-und MBK-Werte, als auch vorteilhafte Absterbekinetiken.Die β-Triketone weisen ähnliche chemische Strukturen auf wie die Gruppe der Tetracycline. Auf Grund des Polyketidweges in der Biosynthese kommt es jeweils zur Ausbildung eines chromophoren Keto-Enol-Systems, welches Abb.39 verdeutlicht. Trotzdem erklärt die strukturelle Verwandschaft allein nicht den Wirkmechanismus der β-Triketone. So zeigten sie sich dem Oxytetracyclin klar unterlegen und können offenkundig die Antibiotika nicht ersetzen. Jedoch steigern sie in vitro die antimikrobielle Aktivität von Teebaum- und Niaouliöl. In vitro Tests sind jedoch nicht ausreichend, um die Qualität umfassend zu beurteilen. Toxikologische Daten bezüglich der akuten oralen Toxizität und Informationen über Interaktionen mit anderen Wirkstoffen sind nötig, um bestimmen zu können, ob die β-Triketone sicher oral aufzunehmen sind oder nicht. Für Leptospermon konnte gezeigt werden, daß es ein leistungsstarker, rein kompetitiver Inhibitor des Arzneistoff-Metabolismus in vitro darstellt (GRAHAM et al., 1970).

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